In Nachts im Museum findet der neu eingestellte Nachtwächter Larry Daley (Ben Stiller) heraus, dass abends, wenn die Besucher nach Hause gehen, das wirkliche Abenteuer beginnt: Dann nämlich erwachen alle ausgestopften, präparierten und gut erhaltenen Bewohner des Museums zum Leben. Das fantastische Abenteuer beginnt mit Larry Daleys Job-Suche. Larry ist ein Tagträumer, dessen grosse Ideen niemals Wirklichkeit wurden und der immer dachte, dass er eigentlich für etwas Grosses bestimmt ist. Er hat natürlich keine Ahnung wie sprichwörtlich gigantisch und haarig die Herausforderung sein wird, als er widerwillig den vermeintlich nicht sehr angesehenen Job in der Nachtschicht als Sicherheitsbeamter im Naturhistorischen Museum übernimmt. In seiner ersten Nacht im Job bekommt Larry eine riesige Taschenlampe und eine Gebrauchsanweisung mit Eselsohren in die Hand gedrückt. Dann wird er alleine gelassen in der unheimlichen Stille des riesigen Museums. Zumindest denkt er, dass er alleine ist. Aber Moment einmal, was ist das für ein Lärm? Ungläubig und voller Verwunderung muss Larry feststellen, dass die prähistorischen Biester und ausgestellten Ikonen um ihn herum auf magische Weise nacheinander zum Leben erwachen – und ein Werk der Zerstörung beginnen. Der Tyrannosaurus Rex und Attila der Hunnenkönig pflügen einen Pfad der Verwüstung durch die Marmor-Korridore. Die Löwen und Affen pirschen um fragile Ausstellungsstücke und Larry hat keine Ahnung, wie er das Museum wieder unter seine Kontrolle bringen könnte. Als er nicht mehr weiter weiß, holt sich Larry die Unterstützung eines historischen Schwergewichts: Der ehemalige US-Präsident und passionierte Jäger Teddy Roosevelt (Robin Williams) unterstützt das Museumsgreenhorn bei seiner Aufgabe.

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